Intrazelluläre Entzündungsaktivität: DNA-Bindungsaktivität des Transkiptionsfaktors NFKB

Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor kappa B (NF-κB)

NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, welcher nach Aktivierung im Zellkern sequenzspezifisch an regulatorische DNA-Motive innerhalb bestimmter Promotor- und Enhancerregionen bindet und dadurch die Transkription verschiedener Gene moduliert. Derzeit sind über 180 Gene bekannt, die von der transkirptionellen Regulation durch NF-κB beeinflusst werden.

Zur Quantifizierung der NF-κB Aktivierung bzw. NF-κB DNA-Bindungsaktivität extrahieren wir zunächst aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) das Gesamtzell-Extrakt. Darin unter anderem enthalten sind Transkriptionsfaktoren aus Zytoplasma und Nukleus. Zur Quantifizierung der NF-κB Aktivierung bzw. NF-κB DNA-Bindungsaktivität verwenden wir einen Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Anstelle von Antikörpern sind bei dieser Assay-Variante Oligonukleotide (NF-κB spezifische Bindungssequenz) an eine feste Phase absorbiert. Aktiviertes NF-κB bindet an diese Oligonukleotide. Nach Zugabe eines Primärantikörpers gegen ein spezifisches NF-κB Epitop sowie eines sekundären Enzym-konjungierten Antikörpers, quantifizieren wir die aktivierte respektive gebundene NF-κB Menge anhand eines Farbumschlags mittels Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader von BioTek. Die Intensität des Farbumschlags verhält sich dabei proportional zu der Menge an gebundenem NF-κB.